Nấm men

2. Nhuộm màu tế bào nấm men:
Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỷ hơn người ta thường sử dụng
các loại thuốc nhuộm để nhuộm cả tế bào hoặc một số phần tế bào nấm men.
Có thể dùng một trong những loại dung dịch thuốc nhuộm sau đây:
- Dung dịch Lugol:
Iot 2g
Iodua Kali 4g
Nước cất 100ml
(Nghiền nhỏ I và KI trong cối sứ rồi sau đó dùng nước hoà tan dần).
- Dung dịch xanh methylen (methylene blue)
Xanh methylen 1g
Nước cất 1000ml
(Có thể pha thành dung dịch 1% sau đó lọc rồi dùng nước cất pha loãng thêm
10 lần nữa).
- Dung dịch fuchsin cacbolic:
Fuchsin kiềm (basic fuchsin) 0,1g
Cồn 900 10ml
Dung dịch phenol 3% 90ml
(Hoà tan fuchsin trong cồn, sau đó trộn đều vào dung dịch phenol).
Có thể dùng que cấy, phết dịch nuôi cấy nấm men thành một lớp mỏng
trên phiến kính sau đó làm khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylen
hay fuchsin cacbolic như khi nhuộm tiêu bản vi khuẩn. Thường người ta dùng
lamelle (lá kính mỏng) để quan sát tế bào nấm men. Lấy một phiến kính sạch
nhỏ lên đó một giọt thuốc nhuộm (xanh methylen chẳng hạn). Giọt thuốc
nhuộm không nên to quá (về sau sẽ tràn khỏi lamelle), cũng không nên nhỏ quá
(tạo thành nhiều bọt khí khi đậy lamelle). Lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 2-3
ngày hoà vào giọt thuốc nhuộm. Đặt một cạnh của lamelle sát vào phía ngoài
giọt mẫu rồi hạ từ từ lamelle xuống cho giọt mẫu tràn đều khắp lamelle. Nếu
tràn ra ngoài thì dùng giấy lọc thấm bớt. Soi ở vật kính nhỏ trước, sau đó
chuyển sang vật kính lớn. Có thể căn cứ vào mức độ bắt màu đậm nhạt để phân
biệt được tế bào sống và tế bào chết. Muốn quan sát các hạt glycogen trong tế
bào nấm men thì nhuộm bằng dung dịch Lugol. Tế bào sẽ có màu vàng nhạt
còn các hạt glicogen có màu đỏ nâu. Muốn quan sát các giọt mỡ trong tế bào
nấm men có thể làm tiêu bản như sau:
Rỏ một giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít nấm men
đã nuôi cấy 48-72 giờ hoà vào giọt formalin. Để yên 5 phút sau đó thêm một
giọt dung dịch thuốc nhuộm xanh methylen, lại thêm một giọt thuốc nhuộm
soudan III. Đặt lamelle dưới kính hiển vi rồi quan sát ta sẽ thấy nguyên sinh
chất của tế bào nấm men bắt màu lam nhạt, không bào không bắt màu còn các
giọt mỡ có màu đỏ hồng.
- Thuốc nhuộm soudan III:
Soudan III 0,05g
Cồn 90% 100ml
Cũng có thể nhuộm các giọt mỡ bằng phương pháp sau đây: Lấy thuốc
nhuộm đen Soudan B (Soudan black B) cho vào ống nghiệm. Dùng que cấy lấy
một ít nấm men hoà vào dịch thuốc nhuộm này. Giữ 20 phút. Lấy khoảng 2
vòng que cấy dịch thuốc nhuộm có nấm men phết lên phiến kính. Làm khô tự
nhiên. Nhuộm tiêu bản trong 30 giây bằng dịch thuốc nhuộm safranin. Rửa
nước, đợi khô rồi soi kính. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men sẽ có màu đỏ
nhạt còn các giọt mỡ có màu đen lam.
- Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon):
Soudan black B 0,3g
Cồn 70% 100ml
(Trộn đều, để 24 giờ rồi mới sử dụng. Dùng trong vòng một tháng).
- Thuốc nhuộm safranin:
Dịch safranin 2,5% (trong cồn 95%) 10ml
Nước cất 100ml
Muốn nhuộm nhân của tế bào nấm men có thể sử dụng phương pháp sau đây:
Lấy một giọt nước đặt lên 1 phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà
vào giọt nước đó rồi dàn thành vết mỏng. Làm khô tự nhiên. Thêm vài giọt
dung dịch picroformol, giữ vài phút sau đó rửa bằng cồn 70%. Ngâm tiêu bản
vào trong dung dịch FeNH4(SO4).12H2O 3% trong 4-7 giờ. Lấy tiêu bản ra
dùng nước rửa sạch sau đó lại ngâm vào dịch thuốc nhuộm hematoxilin 10%
trong 24 giờ. Lấy ra rửa nước rồi lại ngâm vào dịch FeNH4(SO4).12H2O cho
đến khi vừa mất màu thì lấy ra rửa sạch bằng nước, làm khô rồi soi kính.
Nguyên sinh chất của tế bào nấm men có màu tro còn nhân tế bào có màu đen.
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào:
+ Dung dịch picroformol:
Dung dịch acid picric bão hoà 75 phần
Axetit acetic glacial 5 phần
Dung dịch fomol loãng 20 phần
+ Dung dịch ngâm FeNH4(SO4)2.12H2O
FeNH4(SO4)2.12H2O 3g
Nước 100ml
+ Dung dịch thuốc nhuộm hematoxilin
Hematoxilin 1g
Cồn 10ml
Nước 90ml
Hoà tan hematoxilin trong cồn, sau đó thêm nước, đậy nút bông rồi để 1 tháng
sau mới sử dụng.
Để quan sát tế bào nấm men có thể dùng dung dịch nigrozin 5%. Khi đó tế bào
sẽ không bắt màu, có thể phân biệt rõ trên một nền màu lam đen.
Để quan sát bào tử túi (tránh lầm với các không bào) có thể sử dụng một số các
phương pháp nhuộm bào tử đã được giới thiệu trong chương IV (phương pháp
nghiên cứu vi sinh vật học tập 1 NXB KHKT 1971). Cũng có thể nhuộm bào
tử túi bằng phương pháp sau đây: Rỏ 1 giọt nước lên phiến kính. Dùng que cấy
lấy một ít nấm men trộn vào giọt nước, dàn thành vết mỏng, để khô tự nhiên.
Cố định trên ngọn lửa bằng đèn cồn, nhuộm bằng dung dịch lục malachit.
Nhuộm 2 phút, thường xuyên hơ trên ngọn lửa cho bốc hơi (không được đun
sôi). Rửa nước nhẹ, nhuộm thêm 30 giây bằng dung dịch safranin 0,5% trong
nước. Nang bào tử sẽ bắt màu xanh lục còn tế bào dinh dưỡng có màu hồng.
- Dung dịch lục malachit:
Lục malachit (malachite green) 1g
Nước 100ml (không đun nóng)

3. Quan sát quá trình nảy chồi của tế bào nấm men
(sử dụng cho tế bào nấm men dinh dưỡng không có dạng sợi - non
filamelletous vegetative cells).
Cấy một vòng que cấy tế bào nấm men một ngày tuổi vào bình nón loại
100ml chứa 30ml môi trường dịch thể (môi trường nước chiết mạch nha, môi
trường cao nấm men-pepton-glucoza hay môi trường mạch nha - cao nấm men
- glucoza - pepton).
- Môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton:
Cao mạch nha (malt extract) 3g
Cao nấm men (yeast extract) 3g
Glucoza 10g
Pepton 5g
Nước 1000ml
Nuôi cấy trong bình nón ở 25-280C sau hai đến ba ngày tiến hành lấy
mẫu quan sát. Khi quan sát dưới kính hiển vi cần phân biệt được là nấm men
sinh sản theo cách nảy chồi hay phân cắt hoặc cả hai.
- Nếu nảy chồi thì chồi xuất hiện ở đâu? ở cả hai đầu (hai cực) hay ở vị
trí bất kỳ nào trên tế bào? Số lượng chồi trên tế bào mẹ?
- Chồi con sau khi phát triển có rời khỏi tế bào mẹ hay không?
- Dạng và kích thước của tế bào? Chú ý: phương pháp này phải dùng với
các môi trường xác định và ở pha sinh trưởng logarit của tế bào.

4. Quan sát khuẩn ty giả:
Có một số nấm men khi phát triển trong những môi trường nuôi cấy lâu
hay trong những điều kiện thiếu oxy có thể tạo thành những tế bào dài, xếp nối
tiếp nhau, được gọi là khuẩn ty (mycelium). Người ta phân biệt hai loại khuẩn
ty: khuẩn ty giả và khuẩn ty thật. Khuẩn ty thật là các tế bào dạng sợi có vách
ngăn, khuẩn ty giả là các tế bào dạng sợi không có vách ngăn. Việc tạo thành
khuẩn ty là một đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm men. Cũng có một ít
loại nấm men khi phát triển bình thường cũng tạo thành khuẩn ty giả
(pseudomycelium).
Muốn kiểm tra việc tạo thành khuẩn ty người ta thường nuôi cấy nấm
men trên môi trường pepton - glucoza, môi trường khoai tây - glucoza hay môi
trường ngô.
- Môi trường thạch - pepton - glucoza:
Pepton 10g
Glucoza 20g
Thạch 20g
Nước 1000ml
- Môi trường khoai tây - glucoza:
Nước chiết khoai tây 10% 1000ml
Glucoza 20g
Thạch 20g
Cách làm nước chiết khoai tây: cân 100g khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch và
thái nhỏ, thêm 300ml nước, hấp ở áp lực 1at trong 1 giờ sau đó bổ sung nước
cho đủ 1000ml.
- Môi trường ngô:
cân 12,5g ngô, thêm 300ml nước đun cách thuỷ 600C trong 1 giờ, lọc
lấy nước trong. Thêm nước cho đủ 300ml. Sau đó thêm 3,8g thạch. Hấp ở áp
lực 1at trong 15 phút. Lọc nóng qua bông thấm nước rồi phân vào các ống
nghiệm và khử trùng ở áp lực 1at trong 15 phút.
Đổ môi trường vào hộp Petri. Dùng que cấy, cấy nấm men thành 3 cặp
đường song song ngắn, ở 3 chỗ. Dùng panh lấy lá kính mỏng (thường xuyên
ngâm trong còn 70%) đốt nhẹ hết cồn, để nguội một chút rồi cẩn thận đặt nhẹ
nhàng lên vết cấy. Phải cấy thế nào để hai đường cấy song song ở mỗi chỗ có
chiều ngang nằm gọn giữa lá kính mỏng, hai đầu dài hơn lá kính mỏng một
chút (để sau này dễ quan sát). Cần chú ý là bề mặt thạch phải thật khô, khi đậy
lá kính mỏng, phải tránh bọt khí, đậy xong phải tránh di chuyển làm xô lệch lá
kính mỏng.
Cũng có thể tiến hành theo phương pháp sau đây: đổ môi trường vào một
hộp Petri, đợi nguội 600C, dùng panh lấy các phiến kính (lamelle) đặt nhẹ vào
để sao cho có một lớp môi trường bám vào tạo thành lớp mỏng trên một mặt
của phiến kính. Lấp ba phiến kính đã phủ môi trường như vậy đặt vào hộp
Petri khác. Trong hộp Petri này có đựng một ít nước vô trùng và một giá thuỷ
tinh hình chữ U (các phiến kính đặt thẳng góc so với giá thuỷ tinh). Cấy nấm
men thành ba vết trên mỗi phiến kính. Phải cấy ba vết này cách nhau như thế
nào để trên mỗi vết có thể đặt vừa một lá kính mỏng (các vết cấy song song với
chiều rộng của phiến kính). Sau khi đặt lá kính một cách nhẹ nhàng và cẩn thận
ta đậy hộp Petri lại và nuôi cấy ở 25-300C trong 4-5 ngày. Lấy ra và quan sát
các vết cấy dưới kính hiển vi.
Một vài phòng thí nghiệm làm theo cách sau: nhỏ một ít môi trường
thạch nóng lên trên bề mặt phiến kính, láng đều để tạo thành một lớp thật
mỏng. Sau khi khô bề mặt, cấy một hoặc 2 đường dọc theo lam. Lấy lá kính
mỏng đặt lên trên mỗi đường cấy. Đặt phiến kính vào đĩa Petri và cho một ít
nước vô trùng để tránh khô môi trường. Quan sát trên kính hiển vi trong vài
ngày.
Với các phương pháp trên rất dễ dàng quan sát thấy việc tạo thành khuẩn
ty ở một số loại nấm men.
5. Quan sát bào tử bắn (Ballistoconidium, Ballistospore):
Lấy 10-15ml môi trường nước chiết mạch nha, môi trường khoai tây -
glucoza hay môi trường bột ngô đưa vào một đĩa Petri khi thạch đông (nhớ làm
khô vô trùng mặt thạch) lấy que cấy để cấy nấm men theo hai đường vuông
góc ở giữa sau đó úp ngược lên một đĩa Petri khác chứa cùng môi trường
nhưng không cấy nấm men. Trong đĩa Petri này chứa 1 lamelle vô trùng, để ở
200C sau 3 tuần bào tử bắn sẽ tạo thành các khuẩn lạc trên đĩa Petri chứa môi
trường ở phía dưới và lấy phần lamelle mang các bào tử bắn để đưa đi quan sát
dưới kính hiển vi.
- Môi trường bột ngô:
Cân 60 gam bột ngô hoà vào trong 500ml nước sôi. Đun sôi tiếp 1 giờ.
Lọc qua vải màn. Thêm nước cho đủ 1000ml, thêm 20g thạch. Đun cho tan
thạch rồi phân vào các dụng cụ thuỷ tinh. Khử trùng ở nồi áp lực 120 phút
trong 30 phút.
Cũng có thể phát hiện bào tử bắn theo các cách khác như sau:
Cấy các loại nấm men nghi ngờ có hình thành bào tử bắn lên môi trường
thạch - mạch nha (trên đĩa Petri hay ống nghiệm thạch nghiêng). Sau mấy ngày
nuôi cấy trên mặt thủy tinh đối diện với vết cấy sẽ có một hình ảnh mờ giống
hệt với hình dáng vết cấy. Đó là các bào tử bắn đã bắn ra lưu lại trên phía đối
diện vết cấy.
Hoặc cấy nấm men theo đường thẳng hoặc zich zăc vào đĩa Petri chứa
môi trường bột ngô, để ở 200C sau từng thời điểm 3, 5,7,10, 15 ngày. Úp
ngược đĩa Petri lên một phiến kính sạch, để qua đêm. Quan sát bào tử bắn trên
phiến kính trên kính hiển vi.

6. Quan sát bào tử túi (ascospore):
Một số nấm men có khả năng hình thành bào tử hữu tính gọi là bào tử túi
(ascospore hay asconidium). Bào tử túi có khả năng bảo vệ nấm men chống lại
với nhiều ảnh hưởng có hại của điều kiện ngoại cảnh. Thường quan sát thấy
bào tử túi của nấm men trong những môi trường nuụi c?y lõu Có thể là do việc
tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất đã kích thích quá trình tạo thành bào tử
túi. Trong tế bào của mỗi loại nấm men sinh bào tử túi thường tạo thành một số
lượng bào tử túi nhất định. Khi chứa bào tử túi thì tế bào được gọi là túi (asci,
số ít - ascus).
Thường mỗi túi có 4 bào tử, một số loài chỉ có 1-2 bào tử, một số rất ít
loài lại có tới 8 bào tử. Bào tử túi ở nấm men có hình dạng rất khác nhau, đây
cũng là một đặc điểm thường dùng khi phân loại nấm men. Saccharomyces
cerevisiae và rất nhiều loài nấm men khác có bào tử túi hình cầu hay hình
trứng. Hansenula anommala, Hanseniaspora có bào tử túi hình bán cầu, phía
dưới có mép như vành mũ, Pichia membranaefaciens có bào tử túi vô quy tắc
(có thể có hình trứng, dài, tam giác, bầu dục, bán cầu ), Hansenula saturnus có
hình bào tử túi hình quả xoài, ở giữa có một vành đai nhỏ. Bào tử túi
Schawanniomyces occidentalis cũng có hình dạng tương tự như vậy nhưng bề
mặt có gai. Một số loại nấm men lại có bào tử túi dài, có khi hình xoắn.
Thường thường nấm men tạo thành bào tử túi sau 5-10 ngày nuôi cấy trên môi
trường thạch mạch nha. Muốn quan sát chỉ việc lấy một ít nấm men làm tiêu
bản soi tươi không cần nhuộm màu. Mục đích việc quan sát bào tử túi phải trả
lời ba câu hỏi sau đây:
1. Nấm men có hình thành bào tử túi hay không.
2. Bào tử túi hình thành từ các tế bào dinh dưỡng không xảy ra sự
tiếp hợp trước đó hay là sau khi có sự tiếp hợp giữa hai tế bào dinh dưỡng;
cũng có thể là xảy ra sau khi có sự tiếp hợp giữa tế bào mẹ và tế bào con (tế
bào nảy chồi) của nó.
3. Nghiên cứu hình dạng bào tử và số lượng của bào tử túi
Cách tiến hành:
Nấm men ‘trẻ’ sau khi nuôi cấy qua đêm được đưa vào môi trường malt -
cao nấm men - glucoza - pepton và để 2-3 ngày sau đó đưa chuyển vào môi
trường sinh bào tử. Giữ ở 250C trong 3 ngày và quan sát dưới kính hiển vi.
Nếu không quan sát thấy bào tử thì lại tiếp tục giữ và quan sát từng tuần cho
đến 6 tuần liền. Các môi trường hình thành bào tử có thể được sử dụng là môi
trường: V-8-agar, Gorodkowa-aga, acetat-agar, malt-yeast-glucoza, pepton-
agar, malt-acetat-agar. Tuy nhiên thường sử dụng các môi trường sau:
a. Môi trường miếng thạch cao:
Lấy hai phần bột thạch cao trộn với một phần nước làm thành bột nhão
sau đó đổ vào những cái khuôn làm bằng giấy da bò hay giấy thiếc (đường
kính 1-1,5cm, cao 1,5-2cm). Dùng dao làm cho nhẵn bề mặt. Sau khi thạch cao
đông ta loại bỏ khuôn giấy rồi cho vào những hộp thủy tinh đặc biệt gọi là hộp
Koch. Cũng có thể làm những miếng thạch cao hình tròn sau đó cho vào hộp
Petri. Đổ nước ngập 2/3 chiều dày của miếng thạch cao sau đó đưa đi khử
trùng (1200C trong 30 phút). Cấy nấm men tươi (từ thạch nghiêng mới nuôi
cấy 48 giờ tuổi). Giữ 250C trong vài ngày, lấy ra làm tiêu bản quan sát bào tử
túi. Tsetlin (1913) đề nghị trước khi cấy nấm men sang môi trường miếng
thạch cao nên chuẩn bị nấm men tươi trên môi trường có thành phần sau:
Nước cất: 100 ml
Glucoza: 5 g
KH2PO4: 0,2g
CaCl2: 0,05g
MgSO4: 0,05g
FeSO4: 0,001g
(NH4)2SO4: 0,5g
b. Môi trường miếng thạch cao cải tiến:
Cách tiến hành như trên nhưng bề mặt miếng thạch cao được làm ẩm
bằng nước mạch nha loãng hoặc dung dịch có chứa 2% manitol và 0,5%
KH2PO4.
c. Môi trường Gorodkowa (1908)
Nước thịt: 1 g
Pepton: 1 g
NaCl: 0,5 g
Glucoza: 0,25 g
Thạch: 2 g
Nước: 100ml
d. Xử lý với tia tử ngoại:
Cấy nấm men lên môi trường Gorodkowa (môi trường c) rồi chiếu tia tử
ngoại theo thời gian khác nhau: 5, 10, 15 phút. Sau đó tiếp tục nuôi cấy và
quan sát bào tử túi.
e. Môi trường thạch nước:
Môi trường này là môi trường nghèo chỉ có nước và thạch, không bổ
sung thêm các chất dinh dưỡng khác.
f. Môi trường Amano (1950)
Amano đề nghị dùng phương pháp sau: Cấy truyền hai lần nấm men trên
môi trường thạch thịt pepton, lấy nấm men đã nuôi cấy 24 giờ cấy sang môi
trường sau đây:
Glucoza: 0,4 g
Axetat Na không ngậm nước: 1,4 g

Xem chi tiết: Nấm men